齐秀娟，徐善坤，张威远，林苗苗,方金豹
（中国农业科学院果树生长发育与品质控制重点开放实验室，中国农业科学院郑州果树研究所，郑州 450009）
摘 要：以美味猕猴桃(A.chinensis var.diliciosa) ‘徐香’与长果猕猴桃(A. longicarpa)进行远缘杂交，利用荧光显微镜观察了花粉管行为,常规石蜡切片法观察了受精及胚发育过程的差异，统计了杂交当代种子数量和坐果率。结果表明：种间杂交长果猕猴桃的花粉粒能在美味猕猴桃‘徐香’柱头的乳突细胞表面萌发、生长，但生长速度比对照的缓慢；花粉管在花柱中生长时出现波纹状弯曲、停止生长、胼胝质沿管壁不规则沉积等现象；受精过程延迟；胚胎发育出现异常；坐果率较低。种子总数明显少于种内杂交和种内自然授粉的数量，但正常种子的质量与后者大致相同。
关键词：美味猕猴桃；长果猕猴桃；种间杂交；花粉管行为；受精过程；种子
中图分类号： 文献标识码：A 文章编号：0513-353X
Studies on Compatibility of Interspecific Hybridization Between Actinidia diliciosa ‘Xuxiang’ and A. longicarpa by Anatomy
QI Xiu-juan，XU Shan-kun，ZHANG Wei-yuan，LIN Miao-miao，and FANG Jin-bao※
（Key Laboratory for Fruit Tree Growth, Development and Quality Control / Zhengzhou Fruit Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences，Zhengzhou 450009 China)
Abstract：Following interspecific hybridization between A.chinensis var.diliciosa ‘Xuxiang’ and A. longicarpa, pollen tube behaviour among different crossing combinations was determined using fluorescence microscope, difference in fertilization process and embryo development were observed by conventional paraffin sectioning，and fruit-setting rate and hybrid seed quantity were investigated as well. The results showed that the pollen grains of A. longicarpa which is used by interspecific hybridization germinated and grew on the papillate stigma of ‘Xuxiang’, but the pollen tubes grew slower than those of the control, wave-like pollen tubes, growth stop and random deposition of callose along pollen tube wall were observed. Fertilization process delayed, embryo grew abnormally and the fruit-setting rate of interspecific hybridization was lower. The seed number in fruit was less than that of introspecific hybridization or open pollination, but there was no obvious difference in the quality of regular seed among crossing combinations.
Key wrds：A. diliciosa；A. longicarpa；interspecific hybridization；pollen tube behaviour；fertilization；seed
绝大多数猕猴桃属(Actinidia Lindl.)植物属于雌雄异株，雄株对坐果率、单果质量、可溶性固形物等诸多方面具有直感效应(metaxenia)，笔者已经就这方面进行过研究（齐秀娟 等，2007）。植物远缘杂交通常指植物分类学上不同种、属以上类型间的杂交（景士西，2000）。为创造猕猴桃新的种质，丰富其变异类型，有很多研究者从事远缘杂交的育种实践并对其亲和性展开研究。早在1927年，Fairchil D（1927）成功地进行了软枣猕猴桃与美味猕猴桃的杂交；安和祥等（1993）观察了猕猴桃属4个种、十几个正反交组合花粉管在雌蕊上的行为；母锡金等（1990）报道了猕猴桃属种间杂交后期的胚胎学并成功地进行了胚拯救；梁铁兵和母锡金（1995）报道了美味猕猴桃和软枣猕猴桃种间杂交时花粉管行为和早期胚胎发生。但是针对猕猴桃属植物种间杂交从授粉、受精到种子形成缺乏系统的研究。
‘徐香’是在生产中品质表现优良的美味猕猴桃（A. diliciosa）品种，长果猕猴桃(A. longicarpa) 具有果皮极易剥离、维生素C含量高、有独特的芳香气味（李洁维，2007）等特点。本试验中研究‘徐香’美味猕猴桃和长果猕猴桃种间杂交时花粉管原位萌发、花粉管生长、受精以及胚发育过程，并统计了杂交当代坐果率及种子的数量，以期为种间杂交育种提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 材料
试验于2009年在中国农业科学院郑州果树研究所猕猴桃资源圃（113°71′E，34°71′N）内进行。供试雌性品种为8年生美味猕猴桃‘徐香’。用于人工授粉的雄株为美味猕猴桃‘郑雄1号’种内授粉和长果猕猴桃种间授粉；自然授粉的雄株为美味猕猴桃的混合株系，作为坐果率、种子数量检测试验的对照。‘徐香’花期为5月5-10日；‘郑雄1号’和长果猕猴桃花期均为5月2-8日。园地管理水平一般，管理方法一致，各个树体树势基本一致。
1.2 花粉采集及活力测定
分别采摘授粉用雄株树冠外围中部即将开花的大蕾期花蕾，在室内取下花药，用硫酸纸包好后埋于硅胶内，室温下干燥1 d，将散出的花粉分别收集于贴有标签的干燥小瓶内，置-80 ℃冰箱中保存备用。授粉前取出少量使其恢复到常温状态，采用固体培养基培养法测定花粉生活力。培养基为10 %蔗糖＋150 mg · L-1硼酸＋10 mg · L-1 Ca (NO3) 2·4H2O（姚春潮 等，2005）， 26 ℃条件下培养5 h。两种雄株花粉生活力均大于50 %，可用于授粉。
1.3 杂交处理及其坐果率与成熟果种子性状调查
在‘徐香’猕猴桃树体花蕾完全露白期，选择3株树上花期一致、花质均一的单花预先套袋。纸袋采用中国农业科学院郑州果树研究所果袋公司生产的石榴专用羊皮纸袋。在开花当天上午9-10 时，分别用‘郑雄1号’和长果猕猴桃花粉进行人工点授，之后立即重新套袋，挂牌标记，同时选择自然授粉的花朵为对照，采用不套袋挂牌标记。于授粉后30 d调查坐果率。
各杂交组合果实成熟后采收。待室内自然后熟软化后，用LIBROR ED-H200型电子天平测定单果质量。种子败育鉴定参照母锡金等（1990）的方法。每个杂交组合统计10个果实。
1.4 授粉后花粉管行为的荧光显微镜观察
分别在授粉后1、3、5、7、10、20、30、35、45 h，每株树采集3朵花（果实），用刀片从花柱基部（子房与花柱连接处）切取花柱（含柱头），立即用FAA固定液固定。花柱的压片参照Kho 和 Bear （1968）的方法并略作改动：从固定液中取出花柱，用蒸馏水冲洗2遍，用2 mol · L-1的NaOH放置在65 ℃的恒温箱中软化处理5 h，用0.1 %的苯胺蓝染色液染色(用0.1 mol · L-1 K3PO4溶液配制)3 h，制作压片。在OLYMPUS BX 51型荧光显微镜下观察花粉萌发和花粉管生长情况，选取典型图片拍照。由于‘徐香’猕猴桃的花柱较大，所以先分部分拍照，然后用photoshop软件调整照片对比度，拼接成完整花柱。
1.5 受精及胚发育过程的观察
分别在授粉后20、35、45、55、75、100、120 h以及花后30、60、90、120 d，每种处理分别采集5个子房（幼果）进行FAA固定液固定。常规石蜡切片法制片，切片厚度8～10 µm，铁矾苏木精整体染色，在OLYMPUS BX 51型光学显微镜下观察、摄影。另将部分同种授粉后45 h的石蜡切片进行0.1 %的苯胺蓝染色液染色3 h，置于荧光显微镜下观察。
2 结果与分析
2.1 种间授粉和种内授粉组合的坐果率
调查了授粉后30 d各授粉组合的坐果率情况。从表1可见，种间杂交坐果率明显低于种内杂交和自然授粉。
表1 种间授粉与种内授粉组合坐果率比较
Table 1 Comparison on the fruit-setting rate between interspecific and intraspecific pollination
授粉组合
Crossing combination
授粉花朵数
Number of flowers pollinated
坐果数
Number of fruits obtained
坐果率 ％
Fruit-setting rate
人工种内授粉
Artificial intraspecific pollination
80
70
87.5Aa
人工种间授粉
Artificial interspecific pollination
60
28
46.7Cc
自然种内授粉
Natural intraspecific pollination
80
52
65.0Bb
2.2 种间授粉和种内授粉后花粉管在花柱中的生长差异
猕猴桃的花粉粒及花粉管经过0.1 %水溶性苯胺蓝染色后，在紫外荧光显微镜下可观察到很强的荧光，花粉管的生长过程可以清晰显示出来。‘徐香’猕猴桃花柱为白色，长7～10 mm，柱头呈楔型，其上覆盖一层乳突细胞（图1，1），花柱基部为圆筒状。本试验所观察到的大量材料中，种间、种内传粉后，花粉粒均能在柱头上萌发，花粉萌发率种内大于种间。
授粉后1 h的柱头表面，种内授粉的已有一些荧光点出现（图1，2）；种间授粉的尚未见荧光点出现。授粉后3 h，种内授粉的很多柱头上花粉粒大量萌发，且整齐，多数花粉管已经穿过柱头表面，花粉管先端较细（图1，3）；种间授粉的多数出现了较强的荧光点，个别也已长出了花粉管（图1，4）。授粉后7 h，种内授粉的绝大多数花粉管已经规则进入花柱道生长，并多处出现胼胝质塞，分布较为均匀，荧光较强（图1，5）；种间授粉的花粉粒大量萌发，并生长出了一部分花粉管，但还没有按照正常的生长方向进入花柱道，而是缠结在柱头表面，与柱头的乳突细胞缠绕在一起（图1，6）。授粉后10 h～20 h，种内授粉绝大多数花粉管已长到花柱底部，且花粉管数量庞大（图1，7）；授粉后20 h，种间授粉的花粉管大部分仍在柱头表面纠结，只有很少部分进入花柱道生长，且花粉管呈波纹状扭曲、花粉管顶端膨大呈钝圆形或尖细或缩短成团，部分已生长到花柱1/2的位置（图1，8）。授粉后30 h，种间授粉的花粉管也有极少部分到达了花柱底部（图1，9），胼胝质塞的荧光很强烈，但存在花粉管分布杂乱、扭曲，花粉管内胼胝质分布不均匀、胼胝质塞长短不一等现象（图1，10~11），而且种间授粉的花粉管并不随着授粉时间的延长而生长到花粉管基部（图1，12）。
图 1 种间和种内授粉后花粉管生长情况
1：柱头；2：种内授粉后1 h；3：种内授粉后3 h；4：种间授粉后3 h；5：种内授粉后7 h；6：种间授粉后7 h；7：种内授粉后20 h；8：种间授粉后20 h；9~11：种间授粉后30 h极少数花粉管到达花柱底部，胼胝质分布不均匀，胼胝质筛长短不一；12：种间授粉后45 h。
Fig. 1 Growth of pollen tube following interspecific or introspecific pollination
1：stigma；2：1 h after intraspecific pollination；3：3 h after intraspecific pollination；4：3 h after interspecific pollination；5：7 h after intraspecific pollination；6：7 h after interspecific pollination；7：20 h after intraspecific pollination；8：20 h after interspecific pollination；9-11：A few pollen arrived style base 30 h after interspecific pollination, Callose plugs with different length deposited irregularly；12：45 h after interspecific pollination.
2.3 种间授粉和种内授粉后受精过程的差异
猕猴桃是中轴胎座多心皮（图2，1）浆果，倒生胚珠，蓼型胚囊。胚囊发育成熟时3个反足细胞呈品字形排列，卵细胞圆形，2个助细胞并列，受精前大部分胚囊的2个极核合并成了次生核。花粉管进入子房后直达胚珠，由珠孔进入胚囊，属于珠孔受精。珠被最内层细胞质浓，排列整齐，成为珠被绒毡层。
种内授粉时，极少数距离花柱底部较近的胚囊在授粉后20 h就有花粉管到达其珠孔位置（图2，2）。绝大多数胚囊在授粉后45 h花粉管破坏助细胞，释放两精子（图2，3）。授粉后75 h，很多胚囊内反足细胞已经消失，合子细胞质变浓，初生胚乳核分裂先于合子，即受精极核首先分裂成多个胚乳细胞，但合子还没有变化（图2，4）。授粉后100 h，仍可以见到许多胚囊内的合子没有进行分裂，只有初生胚乳核分裂（图2，5）。在荧光显微镜下观察授粉后45 h的胚囊，发现有的胚囊已经完成受精过程，有的胚囊还未完成受精（图2，6），这是由于花粉管到达的时间不同造成的。
种间授粉时，在授粉后55 h，花粉管生长到达珠孔位置，从一个退化的助细胞的丝状器进入助细胞（图2，7）。授粉后75 h，反足细胞消失，形成合子和初生胚乳核，后者还没有进行分裂（图2，8）。授粉后120 h，合子还没有进行分裂，初生胚乳核进行了一次分裂（图2，9）或很多胚囊内的初生胚乳核消失，只剩下尚未分裂的合子（图2，10），也可以看见一些既没有合子也没有初生胚乳核的胚囊（图2，11），同期可看见刚释放的两个精子向助细胞方向移动（图2，12）。从受精速度上来看，种间授粉比种内授粉进行速度缓慢。
图 2 种间和种内授粉后受精过程观察
1：子房横切，示心皮（Ca）和胚珠原基（Op）；2：种内授粉后20 h，个别花粉管生长已到达胚囊附近；3：种内授粉后45 h，花粉管破坏助细胞，释放两精子；4：种内授粉后75 h，受精后合子细胞质变浓，初生胚乳核分裂先于合子，受精极核分裂已形成多个胚乳细胞时，合子仍未有变化；5：种内授粉后100 h，合子还没有分裂，只有初生胚乳核分裂；6：荧光显微镜下显示种内授粉后45 h完成受精过程，胚囊中高亮显示表示花粉管已进入胚囊；7：种间授粉后55 h，花粉管进入胚囊；8：种间授粉后75 h，反足细胞退化，形成合子和初生胚乳核；9：种间授粉后120 h，合子没有分裂，受精极核进行一次横向分裂；10：种间授粉后120 h，只有未分裂的合子，初生胚乳核消失；11：种间授粉后120 h，没有合子也没有初生胚乳核的胚囊；12：种间授粉后120 h，刚释放的精子。
Fig. 2 Fertilization process following interspecific or introspecific pollination
1：Cross section of ovary, showing carpels（Ca） and ovule primordium(Op)；2：Pollen tube close to embryo sac 20 h after intraspecific pollination；3：Pollen tube destroyed the synergid and released two sperms 45 h after intraspecific pollination；4：75 h after intraspecific pollination，the cytoplasm of zygote became dense, the division of the primary endosperm was earlier than that of the zygote, and the primary endosperm cell divided into endosperm cells while the zygote didn’t divide；5：The zygote didn’t divide while the primary endosperm divided 100 h after intraspecific pollination；6：Fertilzation finished 45 h after intraspecific pollination under the fluorescence microscope. The high light in embryo sac indicated that pollen tube entered embryo sac；7：The pollen tube entered the embryo sac 55 h after interspecific pollination；8：The antipodal cell divided into zygote and primary endosperm 75 h after interspecific pollination；9：The zygote didn’t divide while the polar nucleus had a crosswise division 120 h after interspecific pollination；10：The zygote didn’t divide while the primary endosperm disappeared 120 h after interspecific pollination；11：The embryo sac without any zygote and primary endosperm 120 h after interspecific pollination；12：Sperms just discharged into the embryo sac 120 h after interspecific pollination.
2.4 种间授粉和种内授粉组合种胚生长的差异
花后30 d时，种内授粉的胚囊内出现了大量的游离核，胚乳细胞变得浓厚（图3，1），数量明显多于种间授粉，两种授粉胚囊内合子均尚未分裂。花后60 d时，种内授粉胚乳细胞几乎充满胚囊，其细胞质逐渐变得浓厚，细胞核明显增大，形成了小球形胚（图3，2）；种间授粉胚乳细胞数量很少，也未见小球形胚出现。花后90 d，种内授粉胚体与临近的胚乳细胞形成间隙，并有明显扩大的趋势（图3，3）；种间授粉胚乳细胞数量逐渐变多，但未见胚体出现（图3，4）。花后120 d，种内授粉的胚乳细胞分布于靠胚囊壁内侧周围，出现了心形胚或成熟胚（图3，5）；种间授粉出现胚乳退化（图3，6）、直立胚（图3，7）以及败胚和空胚囊（图3，8）。
图 3 种间和种内授粉后胚胎发育的差异
1：种内授粉后30 d，胚乳细胞变得浓厚；2：种内授粉后60 d，胚乳充满胚囊，球形胚；3：种内授粉后90 d，胚体与临近胚乳细胞形成间隙，并有明显扩大的趋势；4：种间授粉后90 d，胚乳细胞进一步增多，但未见胚体出现；5：种内授粉后120 d，成熟胚；6：种间授粉后后120 d，胚囊中央的胚乳退化为残迹；7：种间授粉后后120 d，多细胞棒形胚(个别胚珠)； 8：种间授粉后120 d，败胚和空胚囊。
Fig. 3 Differences in embryo development after interspecific or intraspecific pollination
1：Concentration of endosperm cells 30 d after intraspecific pollination；2：Embryo sac filled with endosperm 60 d after intraspecific pollination, globular embryo；3：Gap formation between embryo and endosperm cells 90 d after intraspecific pollination；4：Endosperm cells increase more, but no embryo, 90 d after interspecific pollination；5：Mature embryo, 120 d after intraspecific pollination；6：Aborted endosperm in the center of embryo sac, 120 d after interspecific pollination；7：Multi-cell baculiform embryo（few ovule）, 120 d after interspecific pollination ；8：Aborted embryo and empty embryo sac, 120 d after interspecific pollination.
2.5 杂交当代果实种子调查
表2显示，种间杂交与种内杂交和对照相比，单果质量明显变小，种子数量明显变少，而且种间杂交各个性状的变异系数都比种内杂交和对照的高。变异系数最大的是种间杂交的正常种子数（141.7 ％），其次是种间杂交的种子总数（134.3 ％）和种间杂交败育种子数（105.6 ％），都大于100 %，属于强变异，说明该性状在相同杂交组合的不同个体之间的差异极大、性状极不稳定，所以种间杂交获得种子的随机性很强，种间杂交当代果实种子的数量极不稳定。变异系数为0的是种内杂交的正常种子质量，说明种内杂交时虽然单果质量略有变化，但正常种子的质量几乎没有变化。从外观上来看，正常种子大小为2.0～2.2 mm，而败育种子不仅变小，而且干瘪。自然授粉的果实种子总数、败育种子数、正常种子数均最高；败育种子质量以种间杂交的最重。对不同杂交组合的果实单果质量与各类型种子数量做相关性分析，结果为单果质量与种子总数量呈直线相关：y＝10.736x-91.731，r＝0.700 **，这与前人研究结果（Hopping，1976；Grant & Ryugo，1984）基本一致；单果质量与与正常种子数呈直线相关 y＝9.5543x-124.76 ，r＝0.800**；其它没有相关性。说明果实中种子总数和正常种子数影响果实的单果质量，这也解释了种间杂交果实单果质量较小的原因。
表2 杂交当代单果种子数量的比较
Table 2 Comparison in seed number between different pollination combination
授粉组合
Pollination combination
平均单果质量/g
Average fruit weight
( CV/%)
单果种子数
Seed number
( CV/%)
败育种子数
Aborted seed number
( CV/%)
败育种子质量/mg Aborted seed weight
( CV/%)
正常种子数
Normal seed number
( CV/%)
正常种子质量/mg
Normal Weight ( CV/%)
人工种内授粉
Artificial intraspecific pollination
51.7 Aa
(18.2)
459 Ab
（23.1）
60.9 Bb
（54.4）
0. 9 Bb
（22.2）
398 Ab
（24.4）
2.0 Aa
（0）
人工种间授粉
Artificial interspecific pollination
26.7 Bb
(33.3)
61 Bc
（134.3）
7 Cc
（85.3）
1.8Aa
（105.6）
54 Bc
（141.7）
2.0Aa
（19.0）
自然种内授粉
Natural intraspecific pollination
54.5 Aa
(16.9)
557 Aa
（12.2）
134 Aa
（81.6）
0.9 Bb
（22.2）
423 Aa
（25.9）
2.0 Aa
（10.0）
注：CV，变异系数；多重比较采用新复极差法，同字母间差异不显著，小写表示P<0.05水平，大写表示P<0.01水平。
Note：CV, Coefficient Vaviance；Small letters and capital letters in the same column mean significant difference at 0.05 level and 0.01level tested by Duncan’s SSR, respectively.
3 讨论
从本试验的结果来看，美味猕猴桃‘徐香’与长果猕猴桃种间杂交，具有一定程度的杂交不亲和性，而且这种不亲和性存在于授粉、受精以及胚发育的整个过程，即受精前后的双重障碍是导致这种杂交亲和性差的主要原因。具体表现为花粉原位萌发率低，花粉管生长较晚、数量少、波纹状弯曲、胼胝质不规则沉积、末端膨大，受精延迟，胚乳退化、形成空胚腔干瘪种子、坐果率低等现象。花粉管形态变化的上述现象在中华猕猴桃与美味猕猴桃M59杂交(Harvey et al.，1991)，以及美味猕猴桃与软枣猕猴桃杂交时也有报道(梁铁兵和母锡金，1995)，推测花粉管生长受阻的原因与花粉管顶端的生长及胼胝质的不均匀堆积有关。
本研究中，长果猕猴桃对‘徐香’授粉，种子总数下降，种子数量取决于实际受精的胚珠数量。根据前述花粉管行为及受精作用的观察，分析造成这种结果的原因是：（1）柱头对远缘花粉的识别和接受能力使得柱头上花粉的萌发本身数量就少；（2）因沉积胼胝质，异种花粉管在花柱中的生长表现缓慢、扭曲变形或者停止生长，导致实际能进入子房并顺利到达珠孔位置的花粉管数量少，很多胚珠没有完成双受精作用；（3）由于种间杂交后受精过程比较缓慢，当花粉管生长到子房距离花柱基部较远的胚珠位置时，胚囊内的卵细胞以及极核有可能已经不是最佳的受精期。
另外，长果猕猴桃对‘徐香’授粉，败育种子质量比对照高，坐果率较低。分析这种结果产生的原因是：长果猕猴桃授粉时，即使有些花粉管顺利到达珠孔并使胚囊发生了受精作用，但是在受精以后胚胎发育异常，或中途夭折，使得种子形成不饱满，所以败育种子质量比对照高，这种情况在各个调查果实中表现随机性很强，由于很多胚珠不能发育成正常的种子，所以阻碍了继续发育成果实，导致坐果率很低。
种内授粉和自然授粉也产生了一部分败育种子。分析这种结果产生的原因是：有些胚珠离花柱基部较远，一些胚珠根本没有进行受精，或刚刚受精就由于自身营养不良等原因胚胎停止发育较早，导致败育种子的出现。在实际纵切果实观察其切面上的种子时，也观察到在果柄部位瘪种子数量较果实上部多一些。
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